ПЦР-диагностика

ПЦР ( Полимеразная цепная реакция ) Если попытаться описать ПЦР-диагностику в трёх словах, то это, совершенно определённо, будут слова ТОЧНО, НАДЁЖНО, БЫСТРО. На сегодняшний день, ПЦР-диагностика является самым точным и чувствительным методом выявления инфекционных и генетических заболеваний. За 30 лет, с момента своего появления в 1983 году, этот уникальный метод уверенно завоевал весь мир, принеся своему изобретателю Кэрри Мюллису, Нобелевскую премию в области химии за 1993 год. Изящность, простота исполнения, непревзойденные показатели чувствительности и специфичности принесли новому методу небывалую, но абсолютно заслуженную популярность.

Диагностика инфекционных заболеваний, в том числе вызванных трудно культивируемыми микроорганизмами, их генотипирование, оценка вирулентности (степень болезнетворности), определение устойчивости микрофлоры к антибиотикам, пренатальная диагностика генетических заболеваний, биоконтроль препаратов крови — вот неполный перечень направлений, где с успехом применяется ПЦР.

Достоинства ПЦР-диагностики:

Высочайшая специфичность – В процессе анализа в исследуемом материале выделяется фрагмент ДНК, специфичный (присущий) только конкретному возбудителю - бактерии или вирусу. Этот участок ДНК уникален и не характерен ни для одной другой инфекции на Земле. Можно говорить, что специфичность метода достигает 100% или близка к этому. Это позволяет в одном и том же материале, проводить одновременный поиск нескольких возбудителей без какого-либо ущерба качеству.
Высочайшая чувствительность – Метод ПЦР позволяет выявить одну-единственную болезнетворную бактерию среди миллиардов других, предоставив через несколько часов, 50 миллиардов ее копий! Он работает там, где другие методы: микроскопический, бактериологический, иммуноферментный, бессильны. Достоверный диагноз при помощи ПЦР можно ставить по 10 - 100 возбудителям в пробе, в то время как для других тестов эта цифра составляет 1000 - 1000 000.
Оперативность - Постановка реакции занимает всего несколько часов, т.к. не требуется искусственное выращивание возбудителя. Процесс максимально автоматизирован. Таким образом, вся диагностика, от момента сдачи материала на анализ до получения результата, отнимет один день.
Прямое определение возбудителей инфекционных заболеваний – методом ПЦР определяют возбудителя, а не реакцию на его внедрение со стороны организма. Таким образом, появилась возможность точно диагностировать заболевание еще в инкубационном периоде, когда нет никаких клинических или лабораторных признаков болезни.
Абсолютная универсальность - ПЦР позволяет обнаруживать любые ДНК и РНК, даже когда бессильны другие методы. Оборудование, используемое для ПЦР, стандартно, оно не зависит от того, что именно и где именно мы ищем. Для ПЦР-исследования может применяться практически любые материалы, в том числе недоступные для исследования другими методами: слизь, моча, кровь, сыворотка, мокрота, эякулят, соскоб эпителиальных клеток, почва и т.д.

Описание метода

Думается, пришло время, перейти от восторженных эпитетов и хвалебных речей к описанию, собственно ПЦР метода. И постараться сделать это так, чтобы даже максимально далёкий от молекулярной биологии читатель, смог оценить красоту и изящество метода, а заодно уяснить за что же, собственно, дают Нобелевскую премию….

Для начала, нужно понять сущность решаемой задачи и основную проблему, мешающую нам всё устроить легко и просто….

Уже задолго до начала 80-х годов учёным биологам было ясно, что анализ генетической информации содержащеёся в хромосомах любой живой (да и не вполне живой, тоже) клетки, позволяет однозначно определить хозяина этих клеток. Это относится, как к человеку и животным, так и к мельчайшим бактериям и вирусам – без исключений. Вся генетическая информация записана внутри ДНК. Так вот, решаемая в ту пору задача формулировалась весьма просто - хорошо бы найти метод, который позволил бы извлекать из клетки ДНК, и идентифицировать ее по принципу: "Это ДНК вируса гриппа, это - стафилококка, а это - хламидии". Тогда, взяв у человека каплю крови, мокроту, мочу и т.д., можно было бы легко установить, не содержатся ли в этих биологических пробах возбудители инфекций. Но… Во-первых, выделить ДНК из клеток неповрежденной практически невозможно - она рвется в произвольных местах, и даже выделяя её 100 раз из 100 одинаковых клеток, мы получим тысячи кусков генов во фрагментах разной длины. Ясно, что ни сравнивать, ни анализировать тут будет нечего. Во-вторых, даже если каким-то чудом удастся выделить и безошибочно определять ДНК возбудителя инфекции, сложности остаются. Ведь ДНК, например, вируса, содержится в пробе, среди миллиардов других клеток, в таких ничтожных количествах, что её запросто можно не заметить, и получить отрицательный результат вместо положительного. Можно, конечно, искусственно вырастить культуру для увеличения объема вирусной ДНК, но, во-первых, не все возбудители болезней хорошо культивируются в искусственных условиях, и, во-вторых, на это требуется значительное время…

Теперь нам пора разобраться с мироустройством, и начать называть вещи своими именами. Итак, что же это такое ДНК и РНК, как это всё устроено и из чего состоит ?

Каждая клетка любого живого существа (животного, растения, человека, бактерии, вируса) имеет хромосомы. Хромосомы – это хранители генетической информации, которые содержат всю последовательность генов каждого конкретного живого существа, его геном. Каждая хромосома состоит из двух нитей ДНК, закрученных в спираль друг относительно друга. Это весьма напоминает винтовую лестницу, "перила" которой удерживаются вместе за счёт "ступенек".

ДНК (ДезоксирибоНуклеиновая Кислота) имея чрезвычайно сложную структуру, тем не менее, строится из достаточно простых структурных компонентов, тех самых "ступенек" – нуклеотидов.

Нуклеотиды бывают 5-и видов :

Тимин (Thymine) ( T )
Аденин (Adenine) ( A )
Гуанин (Guaninne) ( G )
Цитозин (Citosine) ( C )
Урацил (Uracil) ( U )

Нуклеотиды располагаются друг за другом в строгой индивидуальной последовательности, образуя гены. Один ген может состоять из 20-200 таких нуклеотидов. Например, наш ген, определяющий выработку инсулина, состоит из 60 пар нуклеотидов.

"Ступеньки" в нашей "лестнице", на самом деле не целые, а состоят из 2-х половинок – 2-х разных нуклеотидов. Но всё дело в том, что половинки не могут соединяться, как попало, а только особыми "комплементарными" парами. Комплементарность – это точное взаимное соответствие и взаимное дополнение. Если хотите - единство противоположностей! Нуклеотиды обладают свойством комплементарности, т.е. сцепляться друг с другом могут только нуклеотиды, входящие в одну комплементарную пару. Никакие другие связи в природе не возможны. Это весьма напоминает поведение магнитов, когда южный полюс легко сцепляется с северным, а попытки соединить юг с югом и север с севером обречены на провал… Здесь тоже самое, только полюсов не два, а четыре (попробуйте это себе представить). Свойство комплементарности - ключевое в методе ПЦР.

Комплементарными являются пары Тимин - Аденин и Гуанин – Цитозин.

Практически это означает, что напротив аденина (A) в одной цепочке ДНК, в другой цепочке обязательно стоит тимин (T), а напротив гуанина (G) – цитозин (C). Схематически всё это выглядит следующим образом:

Кроме ДНК, точно такую же структуру имеет РНК ( рибонуклеиновая кислота ), отличающаяся от ДНК тем, что вместо тимина в ней используется урацил и комплементарная пара имеет вид A — U.

РНК – является хранителем генетической информации у некоторых вирусов, которые называются ретровирусами. Наиболее известный и активно изучаемый представитель этого поганого семейства — ВИЧ.

Чтобы представить сложность структуры ДНК и РНК, вдумайтесь в следующий факт: если развернуть спираль ДНК, её длина окажется около ста восьмидесяти сантиметров. Не смотря на то, что размеры клетки исчисляются микронами, из-за очень специфической плотной упаковки спирали, ядро клетки свободно вмещает десятки хромосом.

Итак, пора переходить к решению задачи.

Рассматривая поставленную выше задачу, мы уже увидели две основных проблемы на пути к её решению. Понятно, что с одной стороны, выискивать клетку возбудителя инфекции среди миллионов клеток крови – занятие достаточно бесперспективное, если не сказать бестолковое, а с другой стороны, выделять ДНК из клеток " в рукопашную" – тоже не вариант, из-за опасности порвать на кусочки, всё что мы с таким трудом отыскали… Поэтому, нам очень помог бы какой-нибудь метод, позволяющий активно размножать ДНК, но делающий это только с определёнными, "избранными" экземплярами. Это позволит увеличивать концентрацию интересующей культуры до уровней, безошибочно определяемых и не требующих длительного поиска.

Вот этим чудо-методом и стал метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). В основе метода ПЦР лежит природный процесс — комплементарное достраивание ДНК матрицы, осуществляемое с помощью фермента ДНК-полимеразы. Эта реакция носит название репликации ДНК. Так это звучит сухим академическим языком. Но мы задались целью, объяснить Вам всё, буквально, "на пальцах", а потому продолжим свой рассказ о том, как всё происходит.

На первом этапе реакции надо разъединить двойную нить ДНК. Этот процесс называется денатурацией и проходит при температуре 93 - 95 градусов Цельсия. Уже через 30 - 40 секунд связи нуклеотидов разрываются и вместо двойной цепи получаются две одиночные.

Надо заметить, что если после этого, снова, просто понизить температуру, то разделившиеся половинки достаточно быстро находят друг друга и всё возвращается, практически, к исходному состоянию. Следовательно, нам надо не дать соединиться половинкам интересующей нас ДНК. Как этому помешать? – приставить на её место (хотя бы временно) что-то, что точно соответствует небольшому фрагменту ДНК и в точности повторяет комплементарную последовательность небольшой цепочки нуклеотидов. Тогда, место на половинке-основании окажется занято, при попытке присоединения, свойство комплементарности окажется нарушено, и вторая половинка не сможет прицепиться на своё "законное" место. Это "что-то" названное праймером, синтезируется в научной или промышленной лаборатории и представляет собой цепочку синтетических нуклеотидов (олигонуклеотидов), расположенных в таком же порядке, как и у того вируса (бактерии и так далее), на который делается анализ. Например, если делают анализ на хламидии, то праймер соответствует специфическому участку гена, кодирующего главный белок наружной мембраны (МОМР) Chlamydia trachomatis.

Итак, вторая стадия - присоединение праймеров к ДНК (также называется отжигом) длится от 20 до 60 секунд. Температура отжига равна 50 - 65 градусам (для каждого вида возбудителей, т.е. для каждого праймера, она своя).

На этом этапе мы уже разделили ДНК на две половинки и не даём им соединиться. Теперь самое время достроить каждую половинку до полноценной ДНК. Но температура, при которой это должно произойти, очень высока, по меркам молекулярной биологии – более 70 градусов (выше температуры отжига). Проблема была решена благодаря открытию уникального фермента taq-ДНК-полимеразы, содержащегося у бактерий, обитающих в гейзерах. Особенность этого фермента заключается в его исключительной термостойкости (период полужизни при 95 градусах составляет 40 минут) и высокой рабочей температуре — оптимум работы 72градуса. В клетках, фермент ДНК-полимеразы отвечает за копирование и "ремонт" ДНК и способен удлинять короткие нуклеотидные цепочки праймеров, последовательно присоединяя к одному из концов праймера дополнительные нуклеотиды, таким образом, достраивая цепь до конца. Так ДНК копирует саму себя.

Третий этап - достраивание цепей ДНК. Комплементарное достраивание цепей ДНК происходит от конца к концу цепи в противоположных направлениях, начиная с участков присоединения праймеров. Материалом для синтеза новых цепей ДНК служат добавляемые в раствор "кирпичики" - все те же производные аденина, гуанина, цитозина и тимина. Процесс синтеза катализируется ферментом термостабильной ДНК-полимеразой (Taq-полимеразой) и проходит при температуре 70 - 72 градуса. Время протекания синтеза зависит от длины достраиваемого фрагмента и обычно принимается равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований.

Теперь мы имеем две двойные цепочки ДНК вместо одной, исходной.

Ну а дальше процесс повторяется. Опять температура повышается до 93 - 95 градусов, цепочки разъединяются... и так далее. Обычно за 1 - 2 часа при наличии вирусной ДНК ее становится столько, что не заметить ее, даже при стандартном методе обнаружения становится просто нереально.

Схематично, это выглядит так:

Подведём итог: каждый цикл ПЦР состоит из трех стадий. В первую стадию (денатурация) происходит так называемое раскручивание ДНК – то есть разделение связанных между собой двух цепей ДНК. Во вторую (отжиг) - происходит присоединение праймера к участку нити ДНК. И, наконец, в заключительной третьей стадии, "фермент-строитель" достраивает нити, восстанавливая ДНК. В настоящее время весь этот сложный процесс протекает в одной пробирке и состоит из повторяющихся циклов размножения (амплификаций) определяемой ДНК с целью получения большого количества копий, которые могут быть, затем выявлены обычными методами. То есть из одной нити ДНК мы получаем сотни тысяч или миллионы копий.

Детекция и Real-Time PCR

Полимеразная цепная реакция требует быстрой смены температур, ведь идет она в три этапа. Поначалу для каждой стадии использовали отдельную водяную баню, что сильно увеличивало время получения результата. Поставить "на поток" метод помогли специальные автоматические термостаты - амплификаторы, в которых изменение температуры происходит по заданной программе. Современный амплификатор – сложный электронный прибор, не только управляющий циклами амплификации и поддерживающий необходимые температуры, но и делающий количественные замеры после каждого цикла.

Эта технология называется "Real-Time PCR", или ПЦР в реальном времени. В её основе лежит принцип флуоресцентной детекции продуктов ПЦР непосредственно в ходе амплификации. Детекция продуктов амплификации проводится прямо в реакционной среде через стенки или крышку закрытой пробирки.

Для этого в состав реакционной смеси, наряду с праймерами и другими компонентами реакции, добавлены специальные флуоресцентные метки (зонды). Флуоресцентный зонд выполнен по той же технологии, что и праймер и отличается он него тем, что на одном его конце прикреплена флуоресцентная молекула (флуорофор), а на другом конце расположена специальная молекула-гаситель флуоресценции. За счёт близости гасителя, энергия поглощаемая флуорофором не вызывает флуоресцентного свечения, а целиком передаётся гасителю. При этом, при облучении смеси ультрафиолетом, флуоресцентный отклик полностью отсутствует.

Дальше всё происходит, так же, как было описано выше:

В ходе ПЦР при повышении температуры происходит денатурация ДНК с распадом на две половинки.
Зонд вместе с праймерами присоединяется к комплементарному участку ДНК.
В процессе восстановления и синтеза новой цепи ДНК, фермент ДНК-полимеразы расщепляет этот зонд и разрушает его. При этом флуорофор и гаситель освобождаются, расстояние между ними увеличивается и эффект гашения перестаёт работать. Теперь при облучении смеси ультрафиолетом, мы получим устойчивый флуоресцентный сигнал-отклик от флуорофора.

Изготавливая молекулы флуорофора с разным цветом свечения можно проводить одновременный поиск разных возбудителей в одной пробирке.

Большинство используемых сегодня, для ПЦР диагностики, амплификаторов , относится к классу автоматических, высокоскоростных многофункциональных Real Time аппаратов. Они позволяют проводить множественный ПЦР анализ до 5 мишеней (цветных флуоресцентных красителей) в 96 пробирках одновременно. Это полностью автоматические термоциклеры со встроенным оптическим блоком и возможностью детекции накопления продуктов амплификации непосредственно в пробирке во время протекания реакции. Весь процесс амплификации протекает в закрытых одноразовых пробирках, считывание происходит через прозрачные стенки пробирок, без их открытия. Например, на фото CFX96 Touch, производства американской компании Bio-Rad

Особенности и недостатки метода

Безусловно, ПЦР не идеальный метод, и у него имеются свои недостатки. Но они напрямую связаны с его достоинствами и с тем, что называется "человеческим фактором".

ПЦР – высокотехнологичный метод, требующий соблюдения строжайших правил устройства и оснащения лаборатории. Достаточно сказать, что на рабочем месте, где происходит приготовление и раскапывание смесей по пробиркам, должен быть установлен фильтр биологической очистки со степенью более 99%. Это связано с тем, что в воздухе постоянно присутствует невероятный коктейль из фрагментов ДНК всевозможных живых организмов. И если в процессе подготовки к проведению реакции, образец будет загрязнен — возможно «ложное срабатывание».
С другой стороны, далеко не всегда положительный результат ПЦР означает наличие заболевания. Например, человек пролечился от какого-либо заболевания, но погибший и уже не опасный возбудитель (фактически его останки) будет еще некоторое время находиться среди клеток крови и "разбираться на запчасти" защитной системой организма. Если в этот момент сделать ПЦР – результат окажется положительным.
Другой вариант – это отрицательный результат ПЦР при наличии даже явной клинической картины. Одна из наиболее возможных причин – материал для исследования был взят «не оттуда». Образец должен брать квалифицированный врач, строго следуя инструкции, которую ему дает лаборатория.
При создании праймеров используют специфичный для данного микроорганизма фрагмент ДНК, наименее подверженный изменениям. Он выбирается из так называемой высоко консервативной области ДНК. Но изменчивость микроорганизмов может приводить к тому, что некоторые генотипы или штаммы исследуемого возбудителя могут приобретать и накапливать мутации в амплифицируемом (клонируемом) участке генома, и становиться неуловимыми для данного праймера, и тест-системы, в целом. Таким образом, различные тест-системы — одна из причин, почему анализы, сделанные в разных лабораториях и в разных клиниках "одним и тем же" методом ПЦР могут показывать разные результаты. Чтобы максимально избежать ошибок по вине мутаций, современные стандарты качества, регламентируют объем испытаний тест-системы, прежде чем она попадет на рынок и будет использована для диагностики. Эти испытания включают проверку на перекрестные реакции, а также тестирование всех известных штаммов определяемого возбудителя.

Полный список исследований методом ПЦР и цену на них можно посмотреть в разделе "Прейскурант"